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葡萄糖激酶基因启动子-30位点PCR扩增的实验条件研究
作者:论文网    更新:2016-08-19    来源:论文网    栏目:药学论文

 


     聚合酶链反应(PCR)的开发是用来分析基因失调、恶性疾病和许多感染性疾病。为了避免由于不适合的反应条件导致的错误结果,在一种方法应用于临床常规实验之前要对影响反应结果的因素进行研究。本文就从白细胞中提取的基因组DNA作为模板,研究了应用PCR方法扩增葡萄糖激酶基因的最适实验条件,以便进而研究其与2型糖尿病发生的关系。现以正常人的基因为对象,报告如下。  

        1 材料和方法 
        1.1 材料 
        主要仪器:PE9600基因扩增仪;BIO-RAD Power Pac 3000型电泳仪;Mini-PROTEIN Ⅱ型电泳槽及Gel Doc 1000紫外图像分析系统;TJ-6型低温离心机;430 pH计;p10, p100微量加样器。 
主要试剂:5O D 260的寡核苷酸引物;100m m ol/L的dNTP;低熔点琼脂糖;5U/μl的Taq酶。 
        1.2 方法 
        模板的准备:本文使用的模板是从人体白细胞中应用酚/氯仿/异戊醇提取的基因组DNA [1]。提取的模板用100μl TE缓冲液,60℃加热10-15分钟溶解后,-20℃冰冻保存。 
        目的片段的扩增:寡核苷酸引物根据文献报道设计:上游引物为5’-CAAGGCGATTGAGTGGTCACCATG-3’,下游引物为5’-GACTGTGTCTCTCACATCCTAGCC-3’,扩增片段长度为258个碱基。反应体系中模板1μl,10×缓冲液3μl,加双蒸水至30μl条件不变,分别变化Taq酶、dNTP、引物、Mg 2+的浓度,按94℃预变性5min,后94℃1min,60℃1min,72℃1min进行35个循环,最后72℃延伸5min。用2%琼脂糖凝胶电泳,透射式紫外灯下观察扩增产物片段。  
        2 结果 
        2.1 PCR实验条件 
        2.1.1通常PCR实验的酶用量范围为0.5U-2U。其他扩增条件不变的情况下设定系列Taq酶量0.5~5U之间。 
结果表明,均可以扩增出目的DNA,产物量之间并无差异,但5U时出现非特异性扩增。为了使以后扩增更加有效,选择Taq酶量为1U。 
        2.1.2通常引物的浓度常用的范围为0.1-1μmol/L。高浓度的引物可能会引起反应的错配或非特异性产物。其他扩增条件不变的情况下设定系列引物浓度,范围设计在0.1~1μmol/L的浓度之间。结果表明,均有产物扩出,引物二聚体的浓度依次增加,但引物浓度超过0.3μmol/L时产物量接近最高而二聚体的浓度相对低;当到达1μmol/L时二聚体明显过剩,产物量反而降低;选择引物二聚体较少而产物量高时的引物浓度0.3μmol/L为最佳浓度。 
        2.1.3一般反应中每种dNTP的最终浓度可为20-200μmol/L。本项实验dNTP的浓度设计在20-200μmol/L 
之间,共6个浓度,其他扩增条件不变的情况下设定系列dNTP浓度,范围设计在42-250μmol/L之间。结果表明:产物量随dNTP浓度的增加而增加,但在167μmol/L后产物量并无明显增多,选择其最适dNTP浓度为167μmol/L。 
        2.1.4绝大多数PCR扩增方案中镁离子浓度在0.5 -10 mmol/L之间,但各反应有自己的最适酶离子浓度(差异较大)。其他扩增条件不变的情况下镁离子浓度在0.5-5 mmol/L之间设定6个梯度。结果表明:0.5mmol/L的Mg 2+浓度时扩增产物量很低,而1~2mmol/L的浓度产物量均较高,而2mmol/L后随着Mg 2+浓度的增加产物量有所降低,因此选择其中间值1.5mmol/L为实验中的最佳浓度。  
        3 讨论 
        进行PCR扩增所涉及的实验条件很多,结合众多文献以及前期实验基础,并通过预实验,只对扩增时与产物的特异性及产量影响较大的Taq酶量、引物浓度、镁离子浓度以及dNTP浓度做了研究。 
Taq酶浓度:本实验发现不同来源和不同批次的Taq酶因其活性有不同程度的变化,可导致扩增效率发生明显改变。扩增GCK基因启动子区长258bp的DNA片段效率较高,Taq酶的浓度对扩增体系的影响不大,30μl体系中0.5U的Taq酶就可以扩出目的DNA。而高浓度的Taq酶可以产生非特异性扩增。因此,同一研究中最好使用同一批次的Taq酶;在能检查到足够扩增产物的情况下尽量用低浓度的酶而增加扩增数量。 
引物浓度:过低的引物浓度将导致扩增的失败,而过高的引物浓度又会对PCR的扩增起抑制作用,导致错配,产生非特异性产物,同时产生大量的引物二聚体,所以需要实验来确定最佳引物浓度。另外选择适当厂家合成的高质量引物且进行一定的纯化也是实验成功的关键[2]。 
        dNTP的浓度:高浓度的dNTP会对反应起抑制作用,出现非特异性产物和错配现象,而浓度过低又会降低反应产物量。从理论上讲,dNTP的浓度应为:经50个PCR循环后dNTP的浓度是初浓度的50%左右。  
        Mg2+浓度:Mg 2+浓度是影响Taq酶活性的一个重要因素,此外还影响模板和PCR产物的解链。浓度过高,使反应特异性降低,浓度过低,又会降低Taq酶的活性,使反应产物的产量减少,而且只有游离的Mg 2+才对Taq酶有激活作用。所以依靠实验来确定最佳的Mg2+浓度是必要的。 
        通过上述研究,不仅确定了PCR扩增GCK基因启动子区进而内切酶消化的各种最适实验条件,而且为进一步的大批样本研究奠定了基础,使实验结果更为准确、有效。 

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